竹節(jié)參總皂苷對(duì)不同時(shí)間段腦出血模型大鼠腦損傷的保護(hù)作用
閔靜1，嚴(yán)菊華1，敖明章2( 1. 湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北孝感432000; 2. 華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院)
摘要: 目的研究竹節(jié)參總皂苷( TSPJ) 對(duì)腦出血大鼠腦損傷不同時(shí)間段的影響。方法采用膠原酶法制備腦出血?jiǎng)游锬Ｐ?，?8 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、TSPJ 低、高劑量組共4 組，每組12 只; 造模后6h 灌胃給藥，每12h 1 次，于造模后12、72h 測(cè)各組大鼠腦組織含水量，超氧化物歧化酶、丙二醛含量，IL-6、TNF-α 水平。結(jié)果與模型組比較，72h 高劑量TSPJ 組腦組織含水量減少，超氧化物歧化酶活性增高，丙二醛含量下降，IL-6、TNF-α 水平下降，12h 時(shí)TSPJ 高劑量組超氧化物歧化酶活性增高，TNF-α 下降; 丙二醛、IL-6 含量變化不明顯。結(jié)論TSPJ 能減輕出血性腦損傷，對(duì)受損腦組織發(fā)揮保護(hù)作用，且有時(shí)間依賴性。
關(guān)鍵詞: 竹節(jié)參總皂苷; 腦出血; 腦水含量
中圖分類號(hào): Ｒ965. 1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A 文章編號(hào): 2095-4646( 2014) 03-0194-03
腦出血( intracerebral hemorrhage， ICH) 是一種急癥重癥，嚴(yán)重威脅人們的健康; 腦出血后血凝塊回縮，血腦脊液屏障的破壞，血腫周圍缺血，組織炎癥反應(yīng)等因素都可造成腦組織的水腫，從而引起功能障礙［1］。竹節(jié)參總皂苷( total saponins ofpanax japonicus，TSPJ) 具有**化瘀作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察12h 和72h 兩個(gè)時(shí)間段TSPJ 對(duì)腦出血大鼠腦組織超氧化物歧化酶( SOD) 活性、丙二醛( MDA) 及IL-6、TNF-α 含量的影響，研究其不同時(shí)間段的效果及機(jī)理。
1 材料與方法
1． 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量為240 ～ 280g，清潔級(jí)，由湖北省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào):SCXK( 鄂) 2011 ～ 012; 分組: 大鼠隨機(jī)分為4 組，假手術(shù)組、模型組、TSPJ 低劑量組( 100mg /kg) 、TSPJ 高劑量組( 200mg /kg) ，每組12 只，分別觀察術(shù)后12、72h 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)各項(xiàng)指標(biāo)。TSPJ 組術(shù)后6h 灌胃給藥，假手術(shù)組及模型對(duì)照組灌胃等量生理鹽水，以后12h /次TSPJ 組灌胃給藥，而假手術(shù)組及模型對(duì)照組灌胃等量生理鹽水，各組飼養(yǎng)條件相同。
1． 2 藥品與儀器
竹節(jié)三七樣品采自湖北恩施，采用醇提取法，**稱取樣品50mg，定容于50ml 容量瓶，**吸取樣品液2ml，置50ml 容量瓶中定容，搖勻。由華中科技大學(xué)生命科學(xué)院天然產(chǎn)物實(shí)驗(yàn)室通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，TSPJ 凈含量為33． 3%，用前配成懸濁液，置4℃ 冰箱保存?zhèn)溆?。Ⅶ型膠原酶，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品; 注射用尿激酶( 批號(hào)03290，南京南大藥業(yè)有限責(zé)任公司) ，配制成200 IU / L 的溶液;SOD 試劑盒、MDA 試劑盒( 上海恒遠(yuǎn)生化試劑有限公司) ; IL-6、TNF-α 試劑盒，北京福瑞生物工程有限公司。儀器: 大鼠腦立體定位儀，微量注射儀購(gòu)于北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司; 電子天平( SAＲTOＲ2US，BP211D) ，德國(guó)生產(chǎn); GF-D200半自動(dòng)生化分析儀( 山東高密彩虹分析儀器有限公司) ， 8021 離心機(jī)( 上海手術(shù)器械廠) ; 752 分光
光度儀( 上海精密儀器儀表有限公司) 。
1． 3 模型制備
參照Ｒosenberg 等［2］的方法，根據(jù)包新民大鼠腦立體定位圖譜［3］確定尾狀核的位置: 術(shù)前禁食，自由飲水，大鼠經(jīng)****( 0． 1ml /100g) 腹腔麻醉俯臥位固定于立體定位儀上，據(jù)圖譜調(diào)整立體定位儀于注射點(diǎn)，頭皮正中常規(guī)**后矢狀位切開(kāi)約1． 5cm，暴露前囟點(diǎn)，用骨鉆鉆顱打孔( 直徑約1mm) ，用微量進(jìn)樣器吸取膠原酶2ml，迅速插入已鉆好孔內(nèi)，進(jìn)針5mm，注射時(shí)間不少于15min，留針10min 后緩慢退針，鉆孔用骨蠟封閉，局部**后，縫合皮膚，假手術(shù)組注射2ml 的生理鹽水，手術(shù)過(guò)程同出血組。
1． 4 檢測(cè)方法
1． 4． 1 腦組織含水量測(cè)定
分別于術(shù)后第12h 及第72h，過(guò)量麻醉大鼠，快速斷頭取腦組織，用濾紙吸干腦表面液體和血跡，小塑料封口袋密閉全腦，電子天平稱濕重，然后放入80℃烤箱中，72h 后稱干重。腦含水量計(jì)算公式: ［( 濕重－ 干重) /濕重］× 100%。
1． 4． 2 SOD 活性、MDA 含量測(cè)定
各組動(dòng)物再分兩組分別于術(shù)后第12h 及第72h，過(guò)量麻醉大鼠，快速斷頭取腦組織，微凍硬后取出，置薄膜隔開(kāi)的干冰上，分離出血側(cè)皮質(zhì)及基底節(jié)，4℃下用預(yù)冷的勻漿介質(zhì)制備成10%的腦勻漿置3000r /min 離心15min 后，取上清液按試劑盒方法操作。SOD 活性測(cè)定: 通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，進(jìn)而氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在550nm 處測(cè)其吸光度，通過(guò)公式計(jì)算。MDA 含量的測(cè)定: 通過(guò)過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA 可與硫代***酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm 測(cè)吸光度。
1． 4． 3 IL-6、TNF-α 測(cè)定
分別于術(shù)后第12h 及第72h 手術(shù)，取腦勻漿上清液，按放免試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入分離劑后充分混勻，放室溫20min，離心，吸上清，生化分析儀上測(cè)放射性，以B /T 計(jì)算NSB、SO 結(jié)合百分率，以B /B0 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)及待測(cè)樣品結(jié)合百分率，并查出樣品值。
1． 5 統(tǒng)計(jì)方法
以SPSS 17． 0 統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以珋x ± s 表示，各組間比較采用t 檢驗(yàn)，P ＜ 0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2． 1 TSPJ 對(duì)腦水腫的影響
從表1 可見(jiàn)， 12h 時(shí)TSPJ 組腦出血后的腦組織含水量無(wú)明顯影響， 72h 時(shí)高劑量組TSPJ 組腦出血后的腦組織含水量減少，和模型組比較有顯著性差異( P ＜ 0． 05) 。
2． 2 TSPJ 對(duì)大鼠腦組織SOD 活性、MDA 含量的影響
模型組與假手術(shù)組各時(shí)間段大鼠腦組織SOD 活性、MDA 含量差異極顯著( P ＜ 0． 01 ) ;與模型組比較，TSPJ 高劑量組12h 時(shí)SOD 活性有明顯差異( P ＜ 0． 05 ) ，MDA 含量無(wú)明顯差異，72h 高劑量TSPJ 組SOD 活性增高，差異極顯著( P ＜ 0． 01 ) ，MDA 含量下降，差異性顯著( P ＜ 0． 05) ，見(jiàn)表2。
2．3 TSPJ 對(duì)大鼠腦組織中IL-6、TNF-α 含量的影響
與假手術(shù)組比較，模型組大鼠IL-6、TNF-α 水平增高，差異有非常顯著性( P ＜ 0． 01) ; 與模型組比較，12h 時(shí)低劑量組IL-6 無(wú)明顯差異，高劑量組TNF-α 有差異( P ＜ 0． 05) ，72h 時(shí)高劑量TSPJ 組大鼠IL-6、TNF-α 水平下降( P ＜ 0． 05) ，見(jiàn)表3。
3 討論
在腦出血的病理發(fā)展過(guò)程中，腦組織的繼發(fā)性損傷是腦出血病情加重、預(yù)后**的主要因素［4］。出血性腦損傷的炎性反應(yīng)，由白細(xì)胞粘附血管，血-腦屏障遭破壞，炎性細(xì)胞侵入腦實(shí)質(zhì)等組成。腦出血時(shí)炎性因子表達(dá)增加，增加腦水腫、血管壁通透性、炎細(xì)胞浸潤(rùn)。IL-6 介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附，TNF-α 能促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)并釋放蛋白水解酶，與神經(jīng)元損害密切相關(guān)［5］。實(shí)驗(yàn)中可以看出TSPJ 組腦出血后的腦組織含水量減少，與模型組有顯著性差異( P ＜ 0． 05) ; 并且72h 時(shí)TSPJ 組大鼠腦組織丙二醛含量降低( P ＜0． 05) ，超氧化物歧化酶的活力增高，高劑量TSPJ組極明顯( P ＜ 0． 01) ， 72h 時(shí)高劑量TSPJ 組IL-6、TNF-α 水平明顯下降，與模型組有顯著性差異( P＜ 0． 05) ，推測(cè)腦出血12h 內(nèi)，血腫中的紅細(xì)胞破裂或被吞噬細(xì)胞吞噬，含鐵血黃素游離，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥反應(yīng)較明顯，腦出血第72h 血腫經(jīng)循環(huán)吸收**，炎性細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，炎癥因子減少，所以此時(shí)血腫變小，炎癥反應(yīng)減輕，超氧化物歧化酶的活力增高，丙二醛降低， IL-6、TNF-α 水平明顯下降。因而72h 時(shí)效果明顯除與**作用有關(guān)外，還與**不同發(fā)展階段有關(guān)，所以****和研究還要考慮不同時(shí)間段病變區(qū)別及對(duì)藥效的影響。總而言之，TSPJ 能在一定程度上減少損傷時(shí)自由基生成，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，增加體內(nèi)自由基**劑如超氧化物歧化酶，減少炎癥因子，從而對(duì)顱腦損傷有一定保護(hù)作用。